Презентация на тему репликация днк. Презентация на тему "репликация днк" Презентация на тему репликация днк

Слайд 4

Доказали существование полуконсервативной модели М. Мезельсон и Ф.Сталь в 1958 году. Они выращивали бактерии E.coli несколько поколений на минимальной среде в которой единственным источником азота бы хлорид аммония с меченым атомом N15.В результате все клеточные компоненты бактерий содержали в своем составе тяжелый азот N15.

Слайд 5

Схема опытов Мезелсона и Сталя

Слайд 6

В клеткаx репликация начинается со специфической точки в кольцевой ДНК (область начала репликации) и продолжается в обоих направлениях. В результате образуются две репликативные вилки, которые продвигаются в противоположных направлениях, т. е. обе цепи реплицируются одновременно.

Слайд 7

Каждая репликативная вилка включает по крайней мере две молекулы ДНК-полимеразы III, ассоциированные с несколькими вспомогательными белками. К последним относятся ДНК-топоизомеразы (гиразы), которые раскручивают плотно свернутую двойную спираль ДНК, и хеликазы, которые расплетают двухтяжевую ДНК на две цепи. Поскольку матричная цепь всегда читается в направлении 3"→5", только одна из цепей может считываться непрерывно. Другая цепь считывается в направлении, противоположном движению репликативной вилки. В результате на матрице вначале синтезируются короткие фрагменты новой цепи ДНК, так называемые фрагменты Оказаки, названные так по имени их первооткрывателя.

Слайд 8

Расположение основных белков в репликационной вилке

Слайд 9

Каждый фрагмент начинается с короткой РНК-затравки, необходимой для функционирования ДНК-полимеразы. Праймер синтезируется специальной РНК-полимеразой, ДНК-полимераза III достраивает этот праймер до фрагмента ДНК длиной 1000-2000 дезоксинуклеотидных звеньев. Синтез этого фрагмента далее прерывается, и новый синтез начинается со следующего РНК-праймера. Индивидуальные фрагменты Оказаки первоначально не связаны друг с другом и все еще имеют РНК на 5"-концах. На некотором расстоянии от репликативной вилки ДНК-полимераза I начинает замещать РНК-праймер последовательностью ДНК. В завершение остающиеся одноцепочечные разрывы репарируютсяДНК-лигазой. В образованной таким образом двойной спирали ДНК только одна из цепей синтезирована заново.

Слайд 2

Расшифровка структуры молекулы ДНК помогла объяснить и принцип ее репликации (удвоения) в клетке. Этот принцип состоит в том, что каждая из двух полинуклеотидных нитей молекулы ДНК служит в качестве программы (матрицы) для синтеза новой (комплементарной) нити. В результате на основе одной двухцепочечной молекулы образуются две одинаковые двухцепочечные молекулы, в каждой из которых одна цепочка является старой, а другая - новой (вновь синтезированной). Такой принцип репликации ДНК был назван полуконсервативным.

Слайд 3

Принцип полуконсервативной репликации ДНК

Слайд 4

Поскольку две комплементарные цепочки родительской молекулы ДНК являются антипараллельными, то синтез новой полинуклеотидной цепочки на каждой из них идет в противоположном направлении. В соответствии с этим принципом нуклеотидная последовательность матричной (родительской) нити считывается в направлении 3"→ 5", тогда как синтез новой (дочерней) нити идет в направлении 5" → 3".

Слайд 5

Механизм репликации ДНК является достаточно сложным и, по всей вероятности, различается в случае организмов, содержащих относительно небольшие по размерам молекулы ДНК в замкнутой (кольцевой) форме (многие вирусы и бактерии), и эукариот, клетки которых имеют молекулы огромных размеров, находящиеся в линейной (незамкнутой) форме.

Слайд 6

Небольшая кольцевая молекула ДНК представляет собой одну структурную единицу репликации (репликон), имеющую единственную точку начала (инициации) репликации (О-пункт, coстоящий примерно из 300 нуклеотидов), в которой начинается процесс расхождения (расплетания) двух нитей родительской молекулы и матричного синтеза комплементарных копий (реплик) дочерней ДНК. Этот процесс продолжается непрерывно по длине копируемой структуры и заканчивается в этом же репликоне образованием двух молекул «полуконсервативного» типа. В больших линейных молекулах ДНК эукариот имеется много точек начала репликации и соответствующих им репликонов (от нескольких сотен до десятков тысяч), т. е. такая ДНК является полирепликон-ной.

Слайд 7

При рассмотрении современных представлений о механизме репликации ДНК эукариот можно условно выделить три последовательных этапа этого процесса, происходящего в репликоне, в каждом из которых принимают участие те или иные белки (ферменты).

Слайд 8

Первый этап связан с быстрым раскручиванием двух полинуклеотидных нитей спирализованной молекулы ДНК на определенном ее участке (в границах работающего репликона) и с их разделением путем разрушения водородных связей между парами комплементарных оснований. При этом образуются два одноцепочечных фрагмента родительской молекулы, каждый из которых может выступать в роли матрицы для синтеза комплементарной (дочерней) нити. Этот этап инициируется в соответствующей точке начала репликации и обеспечивается комплексным участием нескольких различных белков. В результате их действия формируется T-образная структура, названная вилкой репликации, в которой две родительские цепочки ДНК уже отделены друг от друга.

Слайд 9

Схема образования репликационной вилки ДНК

Слайд 10

Образовавшаяся вилка репликации быстро продвигается вдоль двойной спирали родительской молекулы ДНК благодаря активности «расплетающего» фермента ДНК-геликазы и при участии группы дестабилизирующих белков. Эти белки обладают способностью связываться только с одноцепочечными (уже раскрученными и разделенными) участками молекулы, препятствуя возникновению на них вторичных складчатых образований («шпилек») за счет случайных соединений между комплементарными нуклеотидами однонитевой структуры. Следовательно, они способствуют выпрямлению однонитевых участков молекулы, что необходимо для нормального выполнения ими матричных функций.

Слайд 11

Быстрое расплетание ДНК с помощью геликазы без дополнительного вращения нитей по отношению друг к другу должно приводить к образованию новых витков (узлов) на участках родительской молекулы перед движущейся вилкой репликации, создающих повышенное топологическое напряжение на этих участках. Такое напряжение устраняется еще одним белком (ДНК-топоизомеразой), который, перемещаясь вдоль двухспиральной родительской ДНК перед вилкой репликации, вызывает временные разрывы в одной из цепочек молекулы, разрушая фосфодиэфирные связи и присоединяясь к разорванному концу.

Слайд 12

Возникший разрыв обеспечивает последующее вращение нити двойной спирали, что, в свою очередь, приводит к расплетанию образующихся супервитков (узлов). Поскольку разрыв полинуклеотидной цепочки, вызванный топоизомеразой, носит обратимый характер, то разорванные концы быстро воссоединяются сразу после разрушения комплекса этого белка с разорванным концом.

Слайд 13

На втором этапе происходит матричный синтез новых (дочерних) полинуклеотидных цепей на основе известного принципа комплементарного соответствия нуклеотидов старой (матричной) и новой цепей. Этот процесс осуществляется путем соединения (полимеризации) нуклеотидов новой цепи с помощью ферментов ДНК-полимераз нескольких типов. Следует отметить, что ни одна из известных сегодня ДНК-полимераз не способна начать синтез нового полинуклеотида путем простого соединения двух свободных нуклеотидов.

Слайд 14

Инициация этого процесса требует наличия свободного 3"-конца какой-либо полинуклеотидной цепочки ДНК (либо РНК), которая соединена с другой (комплементарной) цепочкой ДНК. Иными словами, ДНК-полимераза способна лишь добавлять новые нуклеотиды к свободному 3"-концу имеющегося полинуклеотида и, следовательно, способна наращивать эту структуру только в направлении 5"→3".

Слайд 15

С учетом указанного обстоятельства становится понятным асимметричный характер функционирования вилки репликации. Как видно из приведенных схем, на одной из матричных нитей вилки β"→5") идет относительно быстрый и непрерывный синтез дочерней нити (ведущей, или лидирующей, цепочки) в направлении 5" →3", тогда как на другой матрице (5"→ 3") идет более медленный и прерывистый синтез отстающей цепочки короткими фрагментами (100 - 200 нуклеотидов), получившими название фрагментов Оказаки, и также в направлении 5"→ 3". Считается, что синтез ведущей и отстающей цепочек осуществляют ДНК-полимеразы разных типов.

Слайд 16

Свободный 3"-конец, необходимый для начала синтеза фрагмента Оказаки, обеспечивается короткой нитью РНК (около 10 нуклеотидов), получившей название РНК-праймера (РНК-затравки), которая синтезируется с помощью фермента РНК-праймазы. РНК-праймеры могут комплементарно спариваться сразу с несколькими участками на матричной нити ДНК, создавая условия для одновременного синтеза нескольких фрагментов Оказаки при участии ДНК-полимеразы III.

Слайд 17

Синтез ведущей и отстающей цепей ДНК в области репликационной вилки

Слайд 18

Когда синтезированный фрагмент Оказаки достигает 5"-конца очередного РНК-праймера, начинает проявляться 5"-экзонуклеазная активность ДНК-полимеразы I, которая последовательно выщепляет нуклеотиды РНК в направлении 5"→ 3". При этом удаляемый РНК-праймер замещается соответствующим фрагментом ДНК.

Слайд 19

Последний (третий) этап рассматриваемого процесса связан с действием фермента ДНК-лигазы, который соединяет 3"-конец одного из фрагментов Оказаки с 5"-концом соседнего фрагмента с образованием фосфодиэфирной связи, восстанавливая таким образом первичную структуру отстающей цепочки, синтезируемой в функционирующем репликоне. Дальнейшая спирализация появившегося «полуконсервативного» участка ДНК (закручивание спирали) происходит с участием ДНК-гиразы и некоторых других белков.

Слайд 20

Полирепликонный принцип организации молекулы ДНК различных эукариот, в том числе человека, обеспечивает возможность последовательного копирования генетического материала этих организмов без одновременного раскручивания (деспирализации) всей огромной по размерам и сложно упакованной молекулы, что значительно сокращает время ее репликации. Иными словами, в тот или иной момент времени в одной группе репли-конов молекулы процесс копирования может быть уже завершен объединением и спирализацией соответствующих участков, тогда как в другой группе он только начинается расплетаниемдвухнитевых структур.

Слайд 21

Спасибо за внимание

Посмотреть все слайды

Слайд 1

Описание слайда:

Слайд 2

Описание слайда:

Слайд 3

Описание слайда:

Слайд 4

Описание слайда:

Слайд 5

Описание слайда:

Слайд 6

Описание слайда:

Слайд 7

Описание слайда:

Каждая репликативная вилка включает по крайней мере две молекулы ДНК-полимеразы III, ассоциированные с несколькими вспомогательными белками. К последним относятся ДНК-топоизомеразы (гиразы), которые раскручивают плотно свернутую двойную спираль ДНК, и хеликазы, которые расплетают двухтяжевую ДНК на две цепи. Поскольку матричная цепь всегда читается в направлении 3"→5", только одна из цепей может считываться непрерывно. Другая цепь считывается в направлении, противоположном движению репликативной вилки. В результате на матрице вначале синтезируются короткие фрагменты новой цепи ДНК, так называемые фрагменты Оказаки, названные так по имени их первооткрывателя. Каждая репликативная вилка включает по крайней мере две молекулы ДНК-полимеразы III, ассоциированные с несколькими вспомогательными белками. К последним относятся ДНК-топоизомеразы (гиразы), которые раскручивают плотно свернутую двойную спираль ДНК, и хеликазы, которые расплетают двухтяжевую ДНК на две цепи. Поскольку матричная цепь всегда читается в направлении 3"→5", только одна из цепей может считываться непрерывно. Другая цепь считывается в направлении, противоположном движению репликативной вилки. В результате на матрице вначале синтезируются короткие фрагменты новой цепи ДНК, так называемые фрагменты Оказаки, названные так по имени их первооткрывателя.

Слайд 8

Описание слайда:

Слайд 9

Описание слайда:

Каждый фрагмент начинается с короткой РНК-затравки, необходимой для функционирования ДНК-полимеразы. Праймер синтезируется специальной РНК-полимеразой, ДНК-полимераза III достраивает этот праймер до фрагмента ДНК длиной 1000-2000 дезоксинуклеотидных звеньев. Синтез этого фрагмента далее прерывается, и новый синтез начинается со следующего РНК-праймера. Индивидуальные фрагменты Оказаки первоначально не связаны друг с другом и все еще имеют РНК на 5"-концах. На некотором расстоянии от репликативной вилки ДНК-полимераза I начинает замещать РНК-праймер последовательностью ДНК. В завершение остающиеся одноцепочечные разрывы репарируются ДНК-лигазой. В образованной таким образом двойной спирали ДНК только одна из цепей синтезирована заново. Каждый фрагмент начинается с короткой РНК-затравки, необходимой для функционирования ДНК-полимеразы. Праймер синтезируется специальной РНК-полимеразой, ДНК-полимераза III достраивает этот праймер до фрагмента ДНК длиной 1000-2000 дезоксинуклеотидных звеньев. Синтез этого фрагмента далее прерывается, и новый синтез начинается со следующего РНК-праймера. Индивидуальные фрагменты Оказаки первоначально не связаны друг с другом и все еще имеют РНК на 5"-концах. На некотором расстоянии от репликативной вилки ДНК-полимераза I начинает замещать РНК-праймер последовательностью ДНК. В завершение остающиеся одноцепочечные разрывы репарируются ДНК-лигазой. В образованной таким образом двойной спирали ДНК только одна из цепей синтезирована заново.

Слайд 10

Описание слайда:

Слайд 11

Описание слайда:

Тема: «Репликация ДНК»

Дать характеристику репликации ДНК

3") противоположно направлению движению левой вилки. Соответственно, данная цепь запаздывающая и формируется в виде коротких фрагментовОказаки. Очевидно, таким образом ферментной системе легче преодолеть затруднения, связанные с несовпадением указанных направлений. Заметим, что в случае соседней репликативной вилки положение лидирующей и запаздывающей цепей обратно предыдущему. Здесь уже нижняя цепь является лидирующей, а верхняя -запаздывающей и представленной фрагментами Оказаки. г) Наконец, последнее в этой группе обстоятельство. Образованию каждого фрагмента ДНК (как длинного, таки любого из фрагментов Оказаки) предшествует синтез короткой последовательности (из 10-15 нуклеотидов) РНК-затравки. Дело в том, что основной фермент, синтезирующий ДНК (ДНК-полимераза), не может начинать процесс «с нуля», т. е. в отсутствие олигонуклеотидной последовательности. В противоположность этому, фермент синтеза РНК (РНК-полимераза)такой способностью обладает. Потому-то данному ферменту и «приходится» начинать образование каждого нового фрагмента ДНК. Для синтеза РНК-затравки требуются рибонуклеозидтрифосфаты (рНТФ), а их включение происходит тоже по принципу комплементарности соответствующему участку ДНК. РНК-последовательности отличаются от ДНК-последовательностей лишь двумя обстоятельствами: в нуклеотидах пентоза содержит в положении 2" гидроксильную группу, а в четверке азотистых оснований тимин заменен на урацил (лишенный, по сравнению с тимином, метильной группы). Но эти два отличия существенно сказываются на способности образовывать двухцепочечную структуру. Поэтому последовательности РНК-затравки после завершения синтеза фрагментов ДНК удаляются. Вместо них происходит достраивание (путем удлинения предыдущего фрагмента ДНК) образующихся «брешей». И, наконец, все многочисленные фрагменты ДНК, образованные на одной родительской цепи, сшиваются в единые цепи. Компоненты ферментного комплекса Как уже отмечалось, в процессе репликации ДНК участвует сложный ферментный комплекс, включающий, по некоторым оценкам,1520 белков. Но функция и механизм действия пока выявлены не для всех этих белков, поэтому в нижеследующем описании фигурирует «лишь» 12 наименований. Для удобства изложения разделим перечисляемые белки на3 группы (рис. 1.11). Белки, подготавливающие родительскую ДНК к репликации а) Точки начала репликации на молекуле ДНК имеют специфическую последовательность оснований, богатую парами АТ. Процесс начинается с того, что с каждой такой последовательностью связывается несколько молекул специальных узнающих белков. В случае бактерий такие белки называются DnaA (как первые белки, инициирующие репликацию). Поэтому на рис. 1.11 узнающий белок обозначен буквой А. Можно представить различные причины, по которым становится возможным взаимодействие узнающих белков с точками начала репликации. Среди этих причин: само появление в ядре узнающих белков или их определенная модификация; освобождение точек начала репликации от неких блокирующих элементов; появление в ядре каких-то третьих факторов, необходимых для рассматриваемого взаимодействия; и т. д. Имеющиеся данные свидетельствуют в пользу первого варианта. Но в любом случае ясно, что здесь - одно из ключевых звеньев, контролирующих начало репликации. Узнающие белки, обеспечив связывание ДНК-реплицирующего комплекса, видимо, далее не перемещаются вместе с ним по ДНК. б) Одним же из «первопроходцев» выступает фермент геликаза (от helix - спираль; на рис. 1.11 обозначен буквой Г). Он обеспечивает расплетение в районе репликативной вилки двойной спирали родительской ДНК: последняя разъединяется на одноцепочечные участки. На это затрачивается энергия гидролиза АТФ - по 2 молекулы АТФ на разделение 1 пары нуклеотидов. Видимо, одновременно происходит также вытеснение данного участка ДНК из связи с гистонами и другими хромосомными белками. в) Однако расплетение спирали на некотором участке создает суперспирализацию перед этим участком. Дело в том, что каждая молекула ДНК в целом ряде мест зафиксирована на ядерном матриксе (п. 1.1.1). Поэтому она не может свободно вращаться при расплетении какого-то своего участка. Это и вызывает суперспирализацию, а с ней - образование структурного напряжения, блокирующего дальнейшее расплетение двойной спирали. Проблема решается с помощью ферментов топоизомераз (И на рис. 1.11). Очевидно, они функционируют на еще нерасплетенном участке ДНК, т. е. там, где возникает суперспирализация. Т. н. топоизомераза I разрывает одну из цепей ДНК, перенося ее проксимальный конец на себя (рис. 1.12). Это позволяет дистальному участку ДНК (от места расплетения до места разрыва) вращаться вокруг соответствующей связи целой цепи, что и предупреждает образование супервитков. Впоследствии концы разорванной цепи вновь замыкаются: один из них переносится с фермента на второй конец. Так что процесс разрыва цепи топоизомеразой легко обратим. Имеется также топоизомераза II (бактериальная топоизомераза II называется гиразой). Этот фермент разрывает сразу обе цепи ДНК, опять-таки перенося соответствующие концы на себя. Это еще более эффективно позволяет решать проблему супервитков при расплетении ДНК. г) Итак, «поддерживаемый» топоизомеразами, фермент геликаза осуществляет локальное расплетение двойной спирали ДНК на две отдельные нити. С каждой из этих нитей сразу связываются специальные SSBбелки (от англ. Single Strand Binding Proteins; S нарис. 1.11). Последние обладают повышенным сродством к одноцепочечным участкам ДНК и стабилизируют их в таком состоянии. Заметим: тем самым данные белки отличаются от гистонов, которые связываются в первую очередь с двухцепочечными участками ДНК. Ферменты полимеризации а) Специальный белок выполняет функции активаторапраймазы (АП на рис. 1.11). После чего праймаза (П), используя в качестве матрицы соответствующий участок одноцепочечной ДНК, синтезирует короткую РНКзатравку, или праймер. б) Далее в дело вступают ДНК-полимеразы. У эукариот известно 5 разных ДНК-полимераз. Из них β (бета)- и ε(эпсилон)-полимеразы участвуют в репарации ДНК, γ (гамма)-полимераза - в репликации митохондриальной ДНК, а α (альфа)- и δ (дельта)-полимеразы - в репликации ядерной ДНК. При этом, по некоторым предположениям, α-полимераза связана и с праймазой, и с δ-полимеразой, а последняя, в свою очередь, - с белком PCNA (от англ. Proliferating Cell Nuclear Antigen; P на рис. 1.11). Данный белок выполняет роль «прищепки», которая кре- пит комплекс полимераз к реплицируемой цепи ДНК. Считается, что в «застегнутом» состоянии он, как кольцо, обхватывает цепь ДНК. Тем самым предупреждается преждевременная диссоциация полимераз от данной цепи. Понятно, что ДНК-полимеразы осуществляют последовательное включение дезоксирибонуклеотидов в строящуюся цепь ДНК - комплементарно нуклеотидам родительской цепи. Но, кроме того, эти ферменты, видимо, имеют и ряд других важных активностей. Правда, для эукариотических ДНК-полимераз распределение данных активностей еще не вполне ясно. Поэтому приведем сведения относительно аналогичных бактериальных ферментов. У бактерий основную «работу» по репликации ДНК выполняет ДНК-полимераза III, имеющая структуру димера. Именно с ней связан «зажим» типа белка PCNA. Так вот, помимо ДНК-полимеразной активности, ДНК-полимераза III обладает еще одной - 3"-5"-экзонуклеазной. Последняя срабатывает в тех случаях, когда допущена ошибка и в строящуюся цепь включен «неправильный» нуклеотид. Тогда, распознав дефект спаривания оснований, фермент отщепляет с растущего (3"-) конца последний нуклеотид, после чего опять начинает работать как ДНК-полимераза. Таким образом, происходит постоянный контроль системы за результатом своей деятельности. в) Как мы знаем, новые цепи ДНК образуются вначале в виде фрагментов - относительно коротких (фрагментов Оказаки) и весьма длинных. И каждый из них начинается с праймерной РНК. Когда ферментный комплекс, движущийся по родительской цепи, доходит до РНК-затравки предыдущего фрагмента, «зажим», связывающий ДНК-полимеразу III с родительской цепью ДНК, раскрывается, и данный фермент прекращает работу. В действие вступает ДНК-полимераза I (речь по-прежнему идет о бактериальных ферментах). Она присоединяется к З"-концу растущего фрагмента (рис. 1.14). При этом фермент уже не имеет устойчивой связи с данным фрагментом и с родительской цепью, но зато обладает даже не двумя, а тремя активностями. Первая из них - «передняя», или 5"-»3"-экзонуклеазная активность: последовательное отщепление нуклеотидов с 5"-конца РНК-затравки предшествующего фрагмента. На освобождающееся место фермент включает дезоксирибонуклеотиды, присоединяя их, как обычно, к З"-концу «свое- го» фрагмента (ДНК-полимеразная активность). И, наконец, подобно ДНК-полимеразе III, он «не забывает» проверять и при необходимости корректировать свою деятель- ность - с помощью «задней», или 3"-5"-экзонуклеазной, активности, направленной на удлиняемый фрагмент. Функция ДНК-полимеразы I исчерпывается, когда растущий фрагмент вплотную доходит до дезоксирибонуклеотидов предыдущего фрагмента. Что касается эукариот, то здесь функциональным аналогом бактериальной ДНК-полимеразы III является, видимо, комплекс а- и 5-ДНК-полимераз; при этом корректирующая 3"-» 5"-экзонуклеазная активность присуща 6-ДНК-полимеразе. Функции ДНК-полимеразы I тоже распределены между двумя ферментами: 5"-3"-экзонуклеазная активность (удаление РНК-затравки) осуществляется, вероятно, специальной ну- клеазой (Н на рис. 1.11), а ДНК-полимеразная активность (застраивание «брешей») - ДНК-полимеразой Р (той, что участвует и в репарации). г) Говоря о ферментах полимеризации, нельзя не сказать о самой трудной из связанных с ними проблем. Речь идет о синтезе запаздывающей цепи ДНК: как мы знаем, направление этого синтеза противоположно общему направлению распространения репликативной вилки. Имеются, по крайней мере, две гипотезы, объясняющее это противоречие. По одной из них (рис. 1.15, А), ферментный комплекс периодически прекращает образование лидирующей цепи, переходит на вторую родительскую цепь и синтезирует очереднойфрагмент Оказаки запаздывающей цепи. Затем вновь возвращается на первую родительскую цепь и продолжает удлинять лидирующую цепь строящейся ДНК. По другой версии (рис. 1.15, Б), на второй цепи родительской ДНК (матрице запаздывающей цепи) в процессе репликации формируется петля. Поэтому направление образования фрагмента Оказаки на внутреннем участке петли начинает совпадать с направлением движения полимеразного комплекса.Тогда последний может практически одновременно образовывать сразу обе цепи ДНК - и лидирующую, и запаздывающую. Возможно, с этим связан тот факт, что бактериальная ДНК-полимераза III является димером, а у эукариот а и 8ДНКполимеразы образуют единый комплекс. Но и при таком механизме запаздывающая цепь, как нетрудно убедиться, не может образовываться непрерывно, а только в виде фрагментов. Ферменты, завершающие репликацию ДНК В результате действия всех предыдущих ферментов каждая новосинтезированная цепь оказывается состоящей из фрагментов, вплотную примыкающих друг к другу. «Сшивание» соседних фрагментов осуществляется ДНК-лигазой (Л на рис. 1.11). Как и ДНК-полимеразы, этот фермент образует межнуклеотидную (фосфодиэфирную) связь. Но если в полимеразной реакции одним из участников является свободный дНТФ (дезоксирибонуклеозидтрифосфат),то в ДНК-лигазной реакции оба участника - концевые дНМФ (дезоксирибонуклеозидмонофосфаты) в составе «сшиваемых»фрагментов. По этой причине энергетика реакции иная, и требуется сопряженный гидролиз молекулы АТФ. Заметим также, что ДНК-лигаза «сшивает» только такие одноцепочечные фрагменты, которые находятся в составе двухцепочечной ДНК. Но и это еще не все. Молекула ДНК окажется реплицированной не полностью, если не произойдет специальный процесс репликации ее концов, или теломерных участков. В этом процессе ключевую роль играет фермент теломераза, к которому в последние годы оказалось прикованным внимание очень многих исследователей. Поэтому рассмотрим этот фермент и связанные с ним вопросы более подробно. " width="640"

Основные принципы

Репликация ДНК имеет ряд принципиальных особенностей.

а). Во-первых, субстратами, из которых синтезируются новые цепи ДНК, являются дезоксинуклеозидтрифосфаты (дНТФ), а не дезоксинуклеозидмонофосфаты (дНМФ), входящие в состав ДНК.

Поэтому в ходе включения в цепь ДНК от каждого нуклеотида отщепляются 2 фосфатных остатка. Использование именно дНТФ, а не дНМФ, объясняется энергетическими причинами: образование межнуклеотидной связи требует энергии; источником ее и служит разрыв межфосфатной связи.

б) Во-вторых, репликация ДНК - матричный процесс: каждая синтезируемая (дочерняя) цепь ДНК строится, используя в качестве матрицы одну из цепей исходной (родительской) ДНК.

в) В-третьих, процесс (в отличие, например, от синтеза РНК) является симметричным: матрицами служат обе цепи родительской ДНК.

Также его можно назвать полуконсервативным : по завершении процесса исходные молекулы ДНК оказываются наполовину обновленными. В каждой из дочерних молекул одна цепь родительская (на рис. 1.9 показана сплошной линией), а вторая - новосинтезированная (пунктирная линия).

г) Наконец, очень важный момент касается направления роста и полярности цепей ДНК. Удлинение цепи ДНК (или отдельного ее фрагмента) всегда происходит в направлении от 5"конца к 3"концу. Это означает, что очередной новый нуклеотид присоединяется к 3"концу растущей цепи. Кроме того, поскольку в любой молекуле ДНК комплементарные цепи антипараллельны, то и растущая цепь антипараллельна матричной цепи. Следовательно, последняя считывается в направлении 3" → 5".

Особенности механизма

Отметим еще несколько менее принципиальных, но достаточно важных особенностей, которые можно отнести к механизму репликации ДНК.

а) Процесс репликации осуществляется сложным ферментным комплексом (насчитывающим до 15-20 различных белков). Ключевые компоненты этого комплекса мы укажем позднее. Сейчас же подчеркнем, что при репликации ДНК у эукариот на каждой хромосоме работает не один, а сразу большое количество таких комплексов. Иными словами, на хромосоме имеется много точек начала репликации ДНК. И удвоение ДНК совершается не последовательно от одного конца до другого, а одновременно во многих местах сразу. Это значительно сокращает продолжительность процесса. Так, по нашим оценкам, в сперматогониях на одной хромосоме - в среднем около 40 точек начала репликации, и S-фаза составляет, как уже отмечалось, 15 ч. В отличие от этого, в прелептотенных сперматоцитах хромосомы имеют в среднем всего по 5-6 таких точек, отчего репликация удлиняется до 100 ч.

б) В каждой указанной точке начинают работать два ферментных комплекса: один перемещается по молекуле ДНК в одну сторону, второй - в противоположную. При этом каждый комплекс реплицирует не только одну цепь ДНК, но и другую. Самый сложный вопрос: как при этом удается для обеих родительских цепей (несмотря на их антипараллельность) соблюдать принцип считывания в направлении3" → 5"? Возможные механизмы мы кратко обсудим ниже. Но каков бы ни был механизм, репликация распространяется в обе стороны от каждой точки начала репликации. Говорят, что при этом образуются две репликативные вилки, движущиеся в противоположных направлениях. Между данными вилками появляется постепенно расширяющееся «вздутие», или «глазок»: это уже реплицированные отделы ДНК. В конечном счете, соседние зоны репликации («вздутия») сливаются, и вся молекула ДНК оказывается удвоенной.

в) Ферментный комплекс функционирует так, что одна из двух синтезируемых им цепей растет с некоторым опережением по сравнению с другой цепью. Соответственно, первая цепь называется лидирующей, а вторая - запаздывающей. Важнейшее обстоятельство состоит в том, что лидирующая цепь образуется ферментным комплексом в виде непрерывного очень длинного фрагмента. Его длина (в нуклеотидах), очевидно, равна половине расстояния между двумя соседними точками начала репликации. Для сперматогоний это около 1 600 000 нуклеотидов. На рис. 1.10 такие фрагменты показаны длинными прерывистыми стрелками.

Запаздывающая же цепь образуется в виде серии относительно коротких фрагментов - примерно по 1500 нуклеотидов. Это т. н. фрагменты Оказаки (на рисунке изображены короткими прерывистыми стрелками).

Из рис. 1.10 нетрудно заключить: в виде фрагментов Оказаки синтезируется ферментным комплексом та цепь, направление образования которой противоположно направлению движения соответствующей репликативной вилки.

Так, крайняя левая на рисунке вилка перемещается тоже влево. Для верхней из растущих цепей это совпадает с направлением ее роста: 5" → 3". Поэтому эта цепь является лидирующей и растет в виде длинного непрерывного фрагмента.

А для нижней из растущих цепей то же, единственно разрешенное, направление роста (5" - 3") противоположно направлению движению левой вилки. Соответственно, данная цепь запаздывающая и формируется в виде коротких фрагментовОказаки. Очевидно, таким образом ферментной системе легче преодолеть затруднения, связанные с несовпадением указанных направлений.

Заметим, что в случае соседней репликативной вилки положение лидирующей и запаздывающей цепей обратно предыдущему. Здесь уже нижняя цепь является лидирующей, а верхняя -запаздывающей и представленной фрагментами Оказаки.

г) Наконец, последнее в этой группе обстоятельство.

Образованию каждого фрагмента ДНК (как длинного, таки любого из фрагментов Оказаки) предшествует синтез короткой последовательности (из 10-15 нуклеотидов) РНК-затравки. Дело в том, что основной фермент, синтезирующий ДНК (ДНК-полимераза), не может начинать процесс «с нуля», т. е. в отсутствие олигонуклеотидной последовательности. В противоположность этому, фермент синтеза РНК (РНК-полимераза)такой способностью обладает. Потому-то данному ферменту и «приходится» начинать образование каждого нового фрагмента ДНК. Для синтеза РНК-затравки требуются рибонуклеозидтрифосфаты (рНТФ), а их включение происходит тоже по принципу комплементарности соответствующему участку ДНК.

РНК-последовательности отличаются от ДНК-последовательностей лишь двумя обстоятельствами: в нуклеотидах пентоза содержит в положении 2" гидроксильную группу, а в четверке азотистых оснований тимин заменен на урацил (лишенный, по сравнению с тимином, метильной группы).

Но эти два отличия существенно сказываются на способности образовывать двухцепочечную структуру. Поэтому последовательности РНК-затравки после завершения синтеза фрагментов ДНК удаляются. Вместо них происходит достраивание (путем удлинения предыдущего фрагмента ДНК) образующихся «брешей». И, наконец, все многочисленные фрагменты ДНК, образованные на одной родительской цепи, сшиваются в единые цепи.

Компоненты ферментного комплекса

Как уже отмечалось, в процессе репликации ДНК участвует сложный ферментный комплекс, включающий, по некоторым оценкам,1520 белков. Но функция и механизм действия пока выявлены не для всех этих белков, поэтому в нижеследующем описании фигурирует «лишь» 12 наименований. Для удобства изложения разделим перечисляемые белки на3 группы (рис. 1.11).

Белки, подготавливающие родительскую ДНК к репликации

а) Точки начала репликации на молекуле ДНК имеют специфическую последовательность оснований, богатую парами АТ.

Процесс начинается с того, что с каждой такой последовательностью связывается несколько молекул специальных узнающих белков. В случае бактерий такие белки называются DnaA (как первые белки, инициирующие репликацию). Поэтому на рис. 1.11 узнающий белок обозначен буквой А. Можно представить различные причины, по которым становится возможным взаимодействие узнающих белков с точками начала репликации. Среди этих причин: само появление в ядре узнающих белков или их определенная модификация; освобождение точек начала репликации от неких блокирующих элементов; появление в ядре каких-то третьих факторов, необходимых для рассматриваемого взаимодействия; и т. д. Имеющиеся данные свидетельствуют в пользу первого варианта. Но в любом случае ясно, что здесь - одно из ключевых звеньев, контролирующих начало репликации. Узнающие белки, обеспечив связывание ДНК-реплицирующего комплекса, видимо, далее не перемещаются вместе с ним по ДНК.

б) Одним же из «первопроходцев» выступает фермент геликаза (от helix - спираль; на рис. 1.11 обозначен буквой Г). Он обеспечивает расплетение в районе репликативной вилки двойной спирали родительской ДНК: последняя разъединяется на одноцепочечные участки. На это затрачивается энергия гидролиза АТФ - по 2 молекулы АТФ на разделение 1 пары нуклеотидов. Видимо, одновременно происходит также вытеснение данного участка ДНК из связи с гистонами и другими хромосомными белками.

в) Однако расплетение спирали на некотором участке создает суперспирализацию перед этим участком. Дело в том, что каждая молекула ДНК в целом ряде мест зафиксирована на ядерном матриксе (п. 1.1.1). Поэтому она не может свободно вращаться при расплетении какого-то своего участка. Это и вызывает суперспирализацию, а с ней - образование структурного напряжения, блокирующего дальнейшее расплетение двойной спирали.

Проблема решается с помощью ферментов топоизомераз (И на рис. 1.11). Очевидно, они функционируют на еще нерасплетенном участке ДНК, т. е. там, где возникает суперспирализация.

Т. н. топоизомераза I разрывает одну из цепей ДНК, перенося ее проксимальный конец на себя (рис. 1.12). Это позволяет дистальному участку ДНК (от места расплетения до места разрыва) вращаться вокруг соответствующей связи целой цепи, что и предупреждает образование супервитков. Впоследствии концы разорванной цепи вновь замыкаются: один из них переносится с фермента на второй конец. Так что процесс разрыва цепи топоизомеразой легко обратим.

Имеется также топоизомераза II (бактериальная топоизомераза II называется гиразой). Этот фермент разрывает сразу обе цепи ДНК, опять-таки перенося соответствующие концы на себя. Это еще более эффективно позволяет решать проблему супервитков при расплетении ДНК.

г) Итак, «поддерживаемый» топоизомеразами, фермент геликаза осуществляет локальное расплетение двойной спирали ДНК на две отдельные нити. С каждой из этих нитей сразу связываются специальные SSBбелки (от англ. Single Strand Binding Proteins; S нарис. 1.11). Последние обладают повышенным сродством к одноцепочечным участкам ДНК и стабилизируют их в таком состоянии.

Заметим: тем самым данные белки отличаются от гистонов, которые связываются в первую очередь с двухцепочечными участками ДНК.

Ферменты полимеризации

а) Специальный белок выполняет функции активаторапраймазы (АП на рис. 1.11). После чего праймаза (П), используя в качестве матрицы соответствующий участок одноцепочечной ДНК, синтезирует короткую РНКзатравку, или праймер.

б) Далее в дело вступают ДНК-полимеразы. У эукариот известно 5 разных ДНК-полимераз. Из них β (бета)- и ε(эпсилон)-полимеразы участвуют в репарации ДНК, γ (гамма)-полимераза - в репликации митохондриальной ДНК, а α (альфа)- и δ (дельта)-полимеразы - в репликации ядерной ДНК. При этом, по некоторым предположениям, α-полимераза связана и с праймазой, и с δ-полимеразой, а последняя, в свою очередь, - с белком PCNA (от англ. Proliferating Cell Nuclear Antigen; P на рис. 1.11).

Данный белок выполняет роль «прищепки», которая кре- пит комплекс полимераз к реплицируемой цепи ДНК. Считается, что в «застегнутом» состоянии он, как кольцо, обхватывает цепь ДНК. Тем самым предупреждается преждевременная диссоциация полимераз от данной цепи. Понятно, что ДНК-полимеразы осуществляют последовательное включение дезоксирибонуклеотидов в строящуюся цепь ДНК - комплементарно нуклеотидам родительской цепи. Но, кроме того, эти ферменты, видимо, имеют и ряд других важных активностей. Правда, для эукариотических ДНК-полимераз распределение данных активностей еще не вполне ясно. Поэтому приведем сведения относительно аналогичных бактериальных ферментов.

У бактерий основную «работу» по репликации ДНК выполняет ДНК-полимераза III, имеющая структуру димера. Именно с ней связан «зажим» типа белка PCNA. Так вот, помимо ДНК-полимеразной активности, ДНК-полимераза III обладает еще одной - 3"-5"-экзонуклеазной. Последняя срабатывает в тех случаях, когда допущена ошибка и в строящуюся цепь включен «неправильный» нуклеотид. Тогда, распознав дефект спаривания оснований, фермент отщепляет с растущего (3"-) конца последний нуклеотид, после чего опять начинает работать как ДНК-полимераза. Таким образом, происходит постоянный контроль системы за результатом своей деятельности.

в) Как мы знаем, новые цепи ДНК образуются вначале в виде фрагментов - относительно коротких (фрагментов Оказаки) и весьма длинных. И каждый из них начинается с праймерной РНК. Когда ферментный комплекс, движущийся по родительской цепи, доходит до РНК-затравки предыдущего фрагмента, «зажим», связывающий ДНК-полимеразу III с родительской цепью ДНК, раскрывается, и данный фермент прекращает работу. В действие вступает ДНК-полимераза I (речь по-прежнему идет о бактериальных ферментах). Она присоединяется к З"-концу растущего фрагмента (рис. 1.14). При этом фермент уже не имеет устойчивой связи с данным фрагментом и с родительской цепью, но зато обладает даже не двумя, а тремя активностями.

Первая из них - «передняя», или 5"-»3"-экзонуклеазная активность: последовательное отщепление нуклеотидов с 5"-конца РНК-затравки предшествующего фрагмента. На освобождающееся место фермент включает дезоксирибонуклеотиды, присоединяя их, как обычно, к З"-концу «свое- го» фрагмента (ДНК-полимеразная активность). И, наконец, подобно ДНК-полимеразе III, он «не забывает» проверять и при необходимости корректировать свою деятель- ность - с помощью «задней», или 3"-5"-экзонуклеазной, активности, направленной на удлиняемый фрагмент.

Функция ДНК-полимеразы I исчерпывается, когда растущий фрагмент вплотную доходит до дезоксирибонуклеотидов предыдущего фрагмента. Что касается эукариот, то здесь функциональным аналогом бактериальной ДНК-полимеразы III является, видимо, комплекс а- и 5-ДНК-полимераз; при этом корректирующая 3"-» 5"-экзонуклеазная активность присуща 6-ДНК-полимеразе. Функции ДНК-полимеразы I тоже распределены между двумя ферментами: 5"-3"-экзонуклеазная активность (удаление РНК-затравки) осуществляется, вероятно, специальной ну- клеазой (Н на рис. 1.11), а ДНК-полимеразная активность (застраивание «брешей») - ДНК-полимеразой Р (той, что участвует и в репарации).

г) Говоря о ферментах полимеризации, нельзя не сказать о самой трудной из связанных с ними проблем. Речь идет о синтезе запаздывающей цепи ДНК: как мы знаем, направление этого синтеза противоположно общему направлению распространения репликативной вилки. Имеются, по крайней мере, две гипотезы, объясняющее это противоречие.

По одной из них (рис. 1.15, А), ферментный комплекс периодически прекращает образование лидирующей цепи, переходит на вторую родительскую цепь и синтезирует очереднойфрагмент Оказаки запаздывающей цепи. Затем вновь возвращается на первую родительскую цепь и продолжает удлинять лидирующую цепь строящейся ДНК.

По другой версии (рис. 1.15, Б), на второй цепи родительской ДНК (матрице запаздывающей цепи) в процессе репликации формируется петля. Поэтому направление образования фрагмента Оказаки на внутреннем участке петли начинает совпадать с направлением движения полимеразного комплекса.Тогда последний может практически одновременно образовывать сразу обе цепи ДНК - и лидирующую, и запаздывающую.

Возможно, с этим связан тот факт, что бактериальная ДНК-полимераза III является димером, а у эукариот а и 8ДНКполимеразы образуют единый комплекс. Но и при таком механизме запаздывающая цепь, как нетрудно убедиться, не может образовываться непрерывно, а только в виде фрагментов.

Ферменты, завершающие репликацию ДНК

В результате действия всех предыдущих ферментов каждая новосинтезированная цепь оказывается состоящей из фрагментов, вплотную примыкающих друг к другу.

«Сшивание» соседних фрагментов осуществляется ДНК-лигазой (Л на рис. 1.11). Как и ДНК-полимеразы, этот фермент образует межнуклеотидную (фосфодиэфирную) связь. Но если в полимеразной реакции одним из участников является свободный дНТФ (дезоксирибонуклеозидтрифосфат),то в ДНК-лигазной реакции оба участника - концевые дНМФ (дезоксирибонуклеозидмонофосфаты) в составе «сшиваемых»фрагментов.

По этой причине энергетика реакции иная, и требуется сопряженный гидролиз молекулы АТФ.

Заметим также, что ДНК-лигаза «сшивает» только такие одноцепочечные фрагменты, которые находятся в составе двухцепочечной ДНК.

Но и это еще не все. Молекула ДНК окажется реплицированной не полностью, если не произойдет специальный процесс репликации ее концов, или теломерных участков.

В этом процессе ключевую роль играет фермент теломераза, к которому в последние годы оказалось прикованным внимание очень многих исследователей. Поэтому рассмотрим этот фермент и связанные с ним вопросы более подробно.

Основные принципы

б). Во-вторых, репликация ДНК - матричный процесс: каждая синтезируемая (дочерняя) цепь ДНК строится, используя в качестве матрицы одну из цепей исходной (родительской) ДНК.

Основой при этом является принцип комплементарности: из четырех возможных нуклеотидов (дАТФ, дГТФ, дЦТФ,дТТФ) в состав растущей цепи включается в данный момент тот, который комплементарен нуклеотиду в соответствующем положении родительской цепи.

Основные принципы

в). В-третьих, процесс можно назвать полуконсервативным : по завершении процесса исходные молекулы ДНК оказываются наполовину обновленными. В каждой из дочерних молекул одна цепь родительская, а вторая - новосинтезированная.

г). Удлинение цепи ДНК (или отдельного ее фрагмента) всегда происходит в направлении от 5‘-конца к 3‘-концу. Это означает, что очередной новый нуклеотид присоединяется к 3‘-концу растущей цепи. Кроме того, поскольку в любой молекуле ДНК комплементарные цепи антипараллельны, то и растущая цепь антипараллельна матричной цепи. Следовательно, последняя, матричная цепь, считывается в направлении 3" → 5".

а) Процесс репликации осуществляется сложным ферментным комплексом (насчитывающим до 15-20 различных белков).

При репликации ДНК у эукариот на каждой хромосоме работает не один, а сразу большое количество таких комплексов. Иными словами, на хромосоме имеется много точек начала репликации ДНК. И удвоение ДНК совершается не последовательно от одного конца до другого, а одновременно во многих местах сразу. Это значительно сокращает продолжительность процесса.

Так, в сперматогониях на одной хромосоме - в среднем около 40 точек начала репликации, и S-фаза составляет 15 ч.

Особенности механизма репликации

б) В каждой указанной точке начинают работать два ферментных комплекса: один перемещается по молекуле ДНК в одну сторону, второй - в противоположную. При этом каждый комплекс реплицирует не только одну цепь ДНК, но и другую. Самый сложный вопрос: как при этом удается для обеих родительских цепей (несмотря на их антипараллельность) соблюдать принцип считывания в направлении 3" → 5"?

Один из возможных механизмов мы кратко обсудим ниже. Но каков бы ни был механизм, репликация распространяется в обе стороны от каждой точки начала репликации. Говорят, что при этом образуются две репликативные вилки, движущиеся в противоположных направлениях.

Особенности механизма репликации

в). Ферментный комплекс функционирует так, что одна из двух синтезируемых им цепей растет с некоторым опережением по сравнению с другой цепью. Соответственно, первая цепь называется лидирующей, а вторая - запаздывающей.

Лидирующая цепь образуется ферментным комплексом в виде непрерывного очень длинного фрагмента.

Особенности механизма репликации

Запаздывающая же цепь образуется в виде серии относительно коротких фрагментов - примерно по 1500 нуклеотидов. Это т. н. фрагменты Оказаки.

«Сшивание» соседних фрагментов осуществляется ДНК-лигазой. Как и ДНК-полимеразы, этот фермент образует межнуклеотидную (фосфодиэфирную) связь.

Особенности механизма репликации

Эукариотические хромосомы содержат большое число репликонов. Репликационная вилка начинается с образования особой структуры - репликационного глаза. . Участок, в котором образуется репликационный глаз, называют точкой начала репликации (около 300 нуклеотидов).

Повторение:

• Что является субстратом для синтеза новых цепей ДНК?
• Почему процесс репликации называют полуконсервативным?
• В каком направлении движется фермент ДНК-полимераза?
• В каком направлении происходит образование дочерней полинуклеотидной цепочки ДНК?
• Сколько ферментных комплексов начинают работать в точке инициации репликации?
• Какая цепь называется лидирующей, какая – запаздывающей?
• Что такое фрагменты Оказаки?

Повторение:

• Какие полимеразы участвуют в репликации ядерной ДНК?
• Какие функции в репликации выполняют лигазы?
• Что такое репликационный глаз?